Con la publicación del Decreto 116/1995, de 31 de marzo, de la Consellería de la Presidencia y Administración Pública, por el que se regula el control de las biotoxinas en moluscos bivalvos y otros organismos procedentes de la pesca, el marisqueo y la acuicultura, quedó establecido que es competencia de la Consellería de Pesca, Marisqueo y Acuicultura la vigilancia y control sobre las biotoxinas en las zonas de producción, correspondiendo a la Consellería de Sanidad y Servicios Sociales la vigilancia y control en las fases de transporte, comercialización, transformación y mercados de venta.

Al el objeto de mejorar el seguimiento y control de las biotoxinas marinas en lo que a las biotoxinas P.S.P. y D.S.P. se refiere, se considera necesaria la adaptación de las técnicas analíticas de control de biotoxinas descritas en los anexos I y II del Decreto 116/1995.

En su virtud, por iniciativa de la Consellería de Sanidad y Servicios Sociales y de la Consellería de Pesca, Marisqueo y Acuicultura, a propuesta del conselleiro de la Presidencia y Administración Pública y previa deliberación del Consello de la Xunta de Galicia en su reunión del día veintitrés de abril de mil novecientos noventa y nueve,

DISPONGO:

Artículo único.

Modificar el antedicho Decreto 116/1995 en los citados anexos I y II que pasan a ser como sigue:

ANEXO I

Método de bioensayo para la determinación de biotoxina paralizante (P.S.P.) en moluscos bivalvos y otros organismos procedentes de la pesca, el marisqueo y la acuicultura.

1. Principio. La biotoxina hidrosoluble paralizante (P.S.P.) se extrae en caliente, en medio ácido de una maceración acuosa de la muestra, y posterior determinación usando bioensayo del ratón.

2. Reactivos:

2.1. Ácido clorhídrico PA.

2.2. Hidróxido sódico PA.

2.3. Padrón de referencia de STX.

2.4. Agua destilada.

3. Procedimiento:

3.1. Preparación de la muestra.

En el caso de moluscos bivalvos, limpiarlos externamente con agua limpia. Con ayuda de un cuchillo abrirlos seccionando los músculos abductores y lavar

el contenido de las conchas (vianda o carne), con suficiente cantidad de agua para eliminar todas las materias extrañas que pueda contener. Separar la carne de las conchas apartando los músculos y tejidos que estén en contacto con la misma. No usar el calor ni anestésicos para abrirlos. La vianda o carne se deposita en un embudo de filtración al que previamente se le coloca papel de filtro o en un colador al objeto de separar la mayor cantidad de agua posible. Posteriormente, se coloca la carne o vianda en papel de filtro y se deja secar durante unos minutos.

Con la ayuda de un homogeneizador o molino, se trituran unos 150 g de la muestra hasta conseguir una pasta lo más fina y homogénea posible.

3.2. Extracción de la toxina paralizante (P.S.P.).

Pesar un vaso de precipitados de 600 ml o 1 l y anotar la tara. Añadir 100 g de la muestra triturada, tal como se describió en el punto 3.1. Añadir 100 ml de ClH 0,1 N y con la ayuda de una varita o de un agitador magnético, mezclar hasta que quede empapada toda la carne con el ácido y se obtenga una maceración lo más homogénea posible.

Ajustar el pH entre 2-4, preferentemente alrededor de 3. Para esto añadir NaOH 0,1 N gota a gota con agitación continua. Nunca sobrepasar un pH superior a 4, pues se destruye la saxitoxina (P.S.P.); si fuese necesario disminuir el pH, añadir con continua agitación ClH 5N.

Calentar la mezcla con agitación hasta que empiece a hervir usando una placa calefactora y dejar que hierva durante cinco minutos evitando la formación de espumas. Enfriar hasta la temperatura ambiente; transferir la mezcla a una probeta de 250 ml, y completar el volumen hasta 200 ml para compensar la pérdida de líquido durante la ebullición, verificar que el pH final sea 3 (pH entre 2-4); agitar y homogeneizar. Dejar en reposo hasta que se posen las partes sólidas y quedar translúcido el sobrenadante.

Si fuese necesario, centrifugar a 3.000 rpm durante cinco minutos el líquido sobrenadante. Si el centrifugado no estuviese totalmente límpido, filtrar a través de un papel de filtro recogiendo el filtrado para efectuar la prueba del bioensayo del ratón.

3.3. Prueba del bioensayo del ratón.

Los pesos de los ratones deben ser de 17 a 23 g, usándose preferentemente ratones de peso 20 g ±1 g.

Se deben emplear, como mínimo, tres ratones por muestra para determinar la mediana del tiempo de muerte. (Se podrá utilizar un solo ratón para la determinación inicial del tiempo de muerte).

Inocular a cada ratón por vía intraperitoneal 1 ml del líquido sobrenadante del extracto de la muestra centrifugada. Anotar el tiempo de inoculación (para esto usar un cronómetro que pueda medir segundos). Se considera el ratón muerto en el momento en el que se produce el último movimiento respiratorio.

Si el tiempo de muerte del ratón inoculado para calcular la determinación inicial del tiempo de muerte es menor de cinco minutos, se diluye la muestra (usar diluciones 1:5; 1:10; etc.), para conseguir que el tiempo de muerte esté comprendido entre 5 y 7 minutos.

Cuando sea necesario hacer estas diluciones es preciso ajustar el pH a 3 (rango entre 2-4).

Si el tiempo de muerte del ratón inoculado para calcular la determinación inicial del tiempo de muerte es mayor de 7 minutos (o hay supervivencia) se deberán inocular un mínimo de tres ratones para establecer la toxicidad de la muestra.

Si los ratones sobreviven después de que hayan transcurrido 60 minutos, se dará la prueba por negativa, y se indicará tiempo de no muerte (T.N.M.)>60 minutos.

4. Cálculos.

Calcular la mediana del tiempo de muerte del ratón de las tres pruebas realizadas (desechar aquéllos que T.N.M>60 minutos).

Haciendo uso de la tabla de Sommer calcular el número de unidades ratón (U.R.). Si el peso de los ratones fuese superior a 21 g o inferior a 19 g hacer uso de la tabla de corrección de pesos, y calcular el factor de corrección de peso.

Se multiplican las unidades ratón (U.R.) correspondientes al tiempo de muerte calculado mediante la tabla de Sommer por el factor de corrección de peso para obtener las unidades de ratón corregidas (U.R.C.). Una vez obtenidas las U.R.C. para todos los ratones en la prueba de grupo, se determina la mediana de las U.R.C. para el grupo. Se convierten las U.R.C. en lg equivalentes de saxitoxina por 100 g de vianda, mediante la fórmula siguiente:

lg equivalentes de saxitoxina/100 g de vianda de molusco= U.R.C. en lg/mlxFCxfactor de diluciónx200, siendo:

FC= Factor de conversión a microgramos de toxina equivalente a una unidad ratón.

U.R.C.= U.R. (tabla de Sommer).

El valor final se expresa en microgramos equivalentes de saxitoxina por 100 g de vianda y se considera como potencialmente peligrosas aquellas muestras que contengan más de 80 lg equivalentes de saxitoxina/100 g de vianda.

Se considera tiempo de no muerte (T.N.M. de supervivencia del ratón) cuando éste es superior a 60 minutos o, lo que es equivalente, inferior a 0,875 U.R.

Se define una unidad ratón como la cantidad de toxina contenida en 1 ml de extracto ácido que mata un ratón de 20 g de peso en 15 minutos, y es aproximadamente igual a 0,2 lg de saxitoxina (P.S.P.).

Tabla de Sommer

Tiempo (minutos y segundos)	Unidades ratón (U.R.)	Tiempo (minutos y segundos)	Unidades ratón (U.R.)

1:00	100	55	1,96
10	66,2	5:00	1,92
15	38,3	05	1,89
20	26,4	10	1,86
25	20,7	15	1,83
30	16,5	20	1,80
35	13,9	30	1,74

Tiempo (minutos y segundos)	Unidades ratón (U.R.)	Tiempo (minutos y segundos)	Unidades ratón (U.R.)

40	11,9	40	1,71
45	10,4	45	1,67
50	9,33	50	1,64
55	8,42	6:00	1,60
2:00	7,67	15	1,54
05	7,04	30	1,48
10	6,52	45	1,43
15	6,06	7:00	1,39
20	5,66	15	1,35
25	5,32	30	1,31
30	5,00	45	1,28
35	4,73	8:00	1,25
40	4,48	15	1,22
45	4,26	30	1,20
50	4,06	45	1,18
55	3,88	9:00	1,16
3:00	3,70	30	1,13
05	3,57	10:00	1,11
10	3,43	30	1,09
15	3,31	11:00	1,075
20	3,19	30	1,06
25	3,08	12:00	1,05
30	2,98	13	1,03
35	2,88	14	1,015
40	2,79	15	1,000
45	2,71	16	0,99
50	2,63	17	0,98
55	2,56	18	0,972
4:00	2,50	19	0,965
05	2,44	20	0,96
10	2,38	21	0,954
15	2,32	22	0,948
20	2,26	23	0,942
25	2,21	24	0,937
30	2,16	25	0,934
35	2,12	30	0,917
40	2,08	40	0,898
45	2,04	60	0,875
50	2,00

Tabla de corrección de peso de los ratones

Peso	Factor de corrección	Peso	Factor de corrección

10	0,50	17,5	0,905
10,5	0,53	18	0,93
11	0,56	18,5	0,95
11,5	0,59	19	0,975
12	0,62	19,5	0,985
12,5	0,65	20	1,000
13	0,675	20,5	1,015
13,5	0,70	21	1,03
14	0,73	21,5	1,04
14,5	0,76	22	1,05
15	0,785	22,5	1,06
15,5	0,81	23	1,07
16	0,84
16,5	0,86
17	0,88

5. Cálculo del factor de conversión (FC).

Se procede de la siguiente manera:

Se cogen alícuotas de 10 ml de la solución patrón internacional de 1 lg/ml y se van diluyendo con 10, 15, 20, 25 y 30 ml de agua destilada sucesivamente, hasta llegar a aquella dilución que, en ensayos con un mínimo de tres ratones, tras la inyección intraperitoneal de 1 ml, provocan una mediana del tiempo de muerte del ratón entre 5-7 minutos. El pH de las diluciones debe estar entre 2 y 4. Se hacen ensayos con diluciones adicionales, con incrementos de 1 ml, por ejemplo: si la dilución que provoca una mediana del tiempo de muerte entre 5 y 7 minutos es la de 25 ml de agua añadida, se hacen ensayos con alícuotas de 10 ml de la solución patrón internacional diluida con 24 ml y con 26 ml de agua destilada.

En estos ensayos preliminares se identifican dos o preferiblemente las tres diluciones que provocan una mediana del tiempo de muerte entre 5 y 7 minutos; se hacen ensayos con estas diluciones, en cada caso con un grupo de diez ratones. De nuevo cada ratón debe recibir 1 ml de la dilución, por inyección intraperitoneal.

Se repiten estos ensayos 1 o 2 días después usando las diluciones ya preparadas que provocaron un tiempo de muerte entre 5 y 7 minutos.

Se repite todo el protocolo usando diluciones preparadas a partir de una nueva solución patrón internacional de 1 lg/ml.

Se calcula para cada grupo de diez ratones la mediana del tiempo de muerte. Si todos los grupos de diez ratones inyectados con una dilución dada muestran una mediana de tiempo de muerte menor de 5 minutos o mayor de 7 minutos, se excluye esta dilución del análisis posterior. Pero si la mediana del tiempo de muerte de al menos uno de los grupos está dentro del rango 5-7 minutos, se deben incluir todos los grupos de ratones inyectados con esta dilución en el análisis (aunque la mediana del tiempo de la muerte por algún grupo se encuentre fuera de este rango).

Para cada grupo no excluido del análisis, se consulta la tabla de Sommer para obtener un valor de unidades por ratón por ml a partir de la media del tiempo de muerte. De esta forma para cada grupo se calcula el factor de conversión (FC). Para calcular el factor de conversión (FC), se divide la cantidad de lg STX/ml de la dilución elegida por el número de unidades de ratón (U.R.) encontradas en la tabla de Sommer. El valor de FC, por lo tanto, corresponde a los lg de toxina equivalentes a una unidad ratón. Calcular la media de los valores de FC de cada grupo, utilizando esta media como FC para la monitorización de los ensayos rutinarios.

Se debe comprobar con una periodicidad mínima semestral el valor del FC o en el caso en el que un cambio en las características de los ratones utilizados haga sospechar una variación en el valor del FC. A comprobación del FC se realiza inyectando 5 ratones con una de las diluciones apropiadas de la solución de patrón internacional de 1 lg/ml.

El valor del FC debe estar dentro de un rango definido por el valor del FC ±20%; si no está dentro de este rango, debe repetirse el ensayo con un grupo de 5 ratones y otro de 10; juntando este grupo de 5 ratones con los 5 ya ensayados, se obtienen dos grupos de 10 ratones. Se calcula el FC para cada grupo y se obtiene la media de los dos, que se convertirá en un nuevo valor del FC a utilizar.

Si el nuevo del FC difiere del original en mas de un 20%, indica que hubo un cambio importante en la respuesta de los ratones a la toxina o en la ejecución del ensayo. Variaciones de esta magnitud requieren un nuevo cálculo del valor del FC.

Las comprobaciones repetidas del valor de FC deben diferir entre sí menos de un 20%. Si en sucesivas comprobaciones la diferencia encontrada es más alta, hay que investigar la posible existencia de variables metodológicas no controladas o no reconocidas antes de proseguir los ensayos.

6. Referencias.

6.1. A.O.A.C., Official Methods of Analysis (1995) Offical Method 959.08 Paralytic Shellfish Poison. Biological Method. Chapter 35, pp. 21-22.

6.2. Sommer H., Meyer K.F. (1937) Arch. Pathol., 24, 560.

ANEXO II

Método de bioensayo para la determinación de enterotoxina (D.S.P.) en moluscos bivalvos y otros organismos procedentes de la pesca, el marisqueo y la acuicultura.

1. Principio: las biotoxinas liposolubles (D.S.P.) se extraen en medio orgánico (mediante acetona) de un homogeneizado de la vianda o del hepatopáncreas o glándula digestiva, y posterior investigación usando el bioensayo del ratón.

2. Reactivos:

2.1. Acetona PA.

2.2. Tween 60.

2.3. Agua destilada.

2.4. Éter Dietílico PA.

2.5. Diclorometano PA.

3. Procedimiento:

3.1. Preparación de la muestra:

En el caso de los moluscos bivalvos, limpiarlos externamente con agua limpia. Con ayuda de un cuchillo abrirlos seccionando los músculos abductores y lavar el contenido de las conchas (vianda o carne), con suficiente cantidad de agua para eliminar todas las materias estrañas que pueda contener. Separar la carne de las conchas apartando los músculos y tejidos que estén en contacto con ella. No usar el calor ni anestésicos para abrirlos.

Separar el hepatopáncreas o glándula digestiva del resto de la vianda, desechando ésta. Los hepatopáncreas o glándula digestiva se depositan en un embudo de filtración al que previamente se coloca papel de filtro o en un colador, con objeto de separar la mayor

cantidad de agua. Posteriormente se colocan los hepatopáncreas o glándulas digestivas en un papel de filtro y se dejan secar durante unos minutos.

Con la ayuda de un homogeneizador o molino triturar unos 30 gramos de hepatopáncreas o glándula digestiva hasta conseguir una pasta lo más fina y homogénea posible.

3.2. Extracción de la enterotoxina (D.S.P.).

Pesar 20 g de hepatopáncreas o glándula digestiva triturada y homogeneizada, tal como se describió en el punto 3.1.

Los 20 g de hepatopáncreas o glándula digestiva se extraen con tres porciones sucesivas de 50 ml de acetona cada una, durante cinco minutos a temperatura ambiente.

En cada una de las extracciones se deja sedimentar la fase sólida (hepatopáncreas o glándula digestiva), y se recoge toda la fracción acetónica que queda en la parte superior (se puede hacer usando una pipeta). La fracción acetónica debe estar límpida; si fuese necesario, se filtraría o se decantaría nuevamente.

Las tres fracciones acetónicas combinadas se evaporan usando un rotavapor o una bomba de vacío. Al objeto de ayudar a la evaporación, la fracción acetónica se sumerge en un baño de agua que debe estar a una temperatura que no sobrepase los 60º C.

El extracto acetónico evaporado se redisuelve añadiendo 4 ml de una disolución al 1% en agua de Tween 60 (2.2). La relación peso/volumen obtenido será de 1 ml de solución acuosa al 1% de Tween 60 por cada 5 g de hepatopáncreas o glándula digestiva iniciales.

3.3. Prueba del bioensayo del ratón.

Se inyectan alícuotas de 1 ml de la disolución anterior por vía intraperitoneal a tres ratones machos que tengan un peso aproximado de 20 g. Los ratones se observan durante un tiempo mínimo de 12 horas.

En caso de observar en los ratones una sintomatología que pudiera indicar inequívocamente la presencia de biotoxinas P.S.P., A.S.P. durante aproximadamente la primera media hora posterior a la inyección, o en el caso de realizarse la extracción a partir de molusco eviscerado y con el fin de evitar la interferencia de sales o metales, se seguirá el procedimiento 4.

3.4. Extracción de enterotoxina D.S.P. en moluscos bivalvos y otros organismos procedentes de la pesca, el marisqueo y la acuicultura en los que no se disponga del hepatopáncreas o glándula digestiva.

Cuando en la muestra a analizar no se disponga de hepatopáncreas o glándula digestiva, se puede hacer la extracción de la enterotoxina D.S.P. a partir de toda la vianda. En este caso, será necesario partir de 200 g de vianda. Como práctica general, se utilizará un volumen de acetona igual a tres veces el peso de la muestra a analizar, para la extracción inicial, y un volumen de dos veces el peso de la muestra para una segunda extracción, si bien dependiendo de la especie del molusco, pudiera ser necesario variar estos volúmenes.

Una vez evaporado el extracto acetónico, y al objeto de eliminar interferencias por sales o metales que puedan estar en la muestra se seguirá el procedimiento 4.

4. Procedimiento de eliminación de interferencias.

4.1. Principio. Esta modificación del bioensayo del ratón se basa en el efecto tóxico agudo causado por un extracto orgánico de la muestra analítica evaporada y redisuelta en una solución acuosa de Tween 60. Para la obtención de este extracto, la muestra se extrae primero con acetona. Una vez evaporada la acetona, se realiza una partición del extracto en agua y éter dietílico con el fin de desechar en la fase acuosa las sustancias polares tales como toxinas PSP, toxinas ASP, sales o metales que pudieran interferir con el ensayo.

4.2. Procedimiento.

El extracto acetónico evaporado procedente del punto 3.2 o 3.4 se resuspende en unos 15 ml de agua. Esta suspensión acuosa se extrae con 3 porciones sucesivas de unos 50 ml de éter dietílico. Dado que la solubilidad de las Yessotoxinas es mayor en diclorometano que en éter dietílico, en el caso de sospecharse la presencia de Yessotoxinas en la muestra, es aconsejable sustituir el éter dietílico por diclorometano. Las fases orgánicas combinadas se lavan con dos porciones sucesivas de unos 15 ml de agua para finalmente evaporar la fase orgánica hasta la sequedad.

El extracto evaporado se redisuelve añadiendo 4 ml de una disolución al 1% en agua de Tween 60 (2.2). La relación peso/volumen obtenido será de 1 ml de solución acuosa al 1% de Tween 60 por cada 5 g de hepatopáncreas o glándula digestiva inicial o de 1 ml de solución acuosa al 1% de Tween 60 por cada 50 g de vianda.

4.3. Prueba del bioensayo del ratón.

Se inyectan alícuotas de 1 ml de la disolución anterior por vía intraperitoneal a tres ratones machos que tengan un peso aproximado de 20 g. Los ratones se observan durante un tiempo mínimo de 12 horas.

5. Criterio de positividad.

De producirse la muerte de por lo menos dos de los tres ratones inyectados antes de 12 horas, indicará la presencia de enterotoxina (D.S.P.) en niveles considerados como peligrosos y que pueden provocar un riesgo para la salud pública.

6. Referencias.

6.1. Yasumoto T., Oshima Y. e Yamaguchi M. (1978) Bull. Jap. Soc. Sci. Fish 44, 1249-1255.

6.2. Yasumoto T., Murata M., Oshima Y., Matsumoto K. e Clardy J. (1984) In «Seafood Toxins». Ragelis E.P., De. ACS. 207-214.

6.3. Cacho E. (1993) En «Tercera Aula Ibérica sobre Fitoplancton Tóxico y Biotoxinas Marinas» Mariño J. et al., Eds. 79-82.

6.4. McCulloch A., Boyd R., Freitas S., Foxall R., Jamieson W., Laycock M., Quilliam M. e Wright J. (1989) J. Assoc. Offic. Anal. Chem. 72, 384-386.

Disposición derogatoria

Quedan derogados los anexos I y II del Decreto 116/1995, por el que se regula el control de las biotoxinas en moluscos bivalvos y otros organismos procedentes de la pesca, el marisqueo y la acuicultura y todas las disposiciones de igual o inferior rango que se opongan a lo dispuesto en el presente decreto.

Disposiciones finales

Primera.-Cualquier modificación del presente decreto se realizará a iniciativa conjunta de la Consellería de Sanidad y Servicios Sociales y de la Consellería de Pesca, Marisqueo y Acuicultura.

Segunda.-Se faculta a las consellerías de Sanidad y Servicios Sociales y Pesca, Marisqueo y Acuicultura para dictar, en el ámbito de sus respectivas competencias, las disposiciones necesarias para el desarrollo y ejecución de este decreto.

Tercera.-El presente decreto entrará en vigor al día siguiente de su publicación en el Diario Oficial de Galicia.

Santiago de Compostela, veintitrés de abril de mil novecientos noventa y nueve.

Manuel Fraga Iribarne

Presidente

Jaime Pita Varela

Conselleiro de la Presidencia y Administración Pública