Coa publicación do Decreto 116/1995, do 31 de marzo, da Consellería da Presidencia e Administración Pública, polo que se regula o control das biotoxinas en moluscos bivalvos e outros organismos procedentes da pesca, o marisqueo e a acuicultura, quedou establecido que é competencia da Consellería de Pesca, Marisqueo e Acuicultura a vixilancia e control sobre as biotoxinas nas zonas de producción, correspondendo á Consellería de Sanidade e Servicios Sociais a vixilancia e control nas fases de transporte, comercialización, transformación e mercados de venda.

Co obxecto de mellora-lo seguimento e control das biotoxinas mariñas no que ás biotoxinas P.S.P. e D.S.P. se refire, considérase necesaria a adaptación das técnicas analíticas de control de biotoxinas descritas nos anexos I e II do Decreto 116/1995.

Na súa virtude, por iniciativa da Consellería de Sanidade e Servicios Sociais e da Consellería de Pesca, Marisqueo e Acuicultura, por proposta do conselleiro de Presidencia e Administración Pública e logo de deliberación do Consello da Xunta de Galicia na súa reunión do día vintetrés de abril de mil novecentos noventa e nove,

DISPOÑO:

Artigo único.

Modifica-lo antedito Decreto 116/1995 nos citados anexos I e II que pasan a ser como segue:

ANEXO I

Método de bioensaio para a determinación de biotoxina paralizante (P.S.P.) en moluscos bivalvos e outros organismos procedentes da pesca, o marisqueo e a acuicultura.

1. Principio. A biotoxina hidrosoluble paralizante (P.S.P.) extráese en quente, en medio ácido dunha maceración acuosa da mostra, e posterior determinación usando bioensaio do rato.

2. Reactivos:

2.1. Ácido clorhídrico PA.

2.2. Hidróxido sódico PA.

2.3. Padrón de referencia de STX

2.4. Auga destilada.

3. Procedemento:

3.1. Preparación da mostra:

No caso dos moluscos bivalvos, limpalos externamente con auga limpa. Con axuda dun coitelo abrilos seccionando os músculos aductores e lava-lo contido das cunchas (vianda ou carne), con suficiente cantidade de auga para eliminar tódalas materias estrañas que poida conter. Separa-la carne das cunchas apartando os músculos e tecidos que estean en contacto con ela. Non usa-la calor nin anestésicos para abrilos. A vianda ou carne deposítase nun funil de filtración ó que previamente se lle coloca papel de filtro ou nun coador co obxecto de separa-la maior cantidade de auga posible. Posteriormente, colócase a carne ou vianda en papel de filtro e déixase secar durante uns minutos.

Coa axuda dun homoxeneizador ou muíño, tritúranse uns 150 g da mostra ata conseguir unha pasta o máis fina e homoxénea posible.

3.2. Extracción da toxina paralizante (P.S.P):

Pesar un vaso de precipitados de 600 ml ou 1 l e anota-la tara. Engadir 100 g da mostra triturada, tal como se describiu no punto 3.1. Engadir 100 ml de ClH 0,1 N e coa axuda dunha variña ou dun axitador magnético, mesturar ata que quede empapada toda a carne co ácido e se obteña unha maceración o máis homoxénea posible.

Axusta-lo pH entre 2-4, preferentemente ó redor de 3. Para isto engadir NaOH 0,1N gota a gota con axitación continua. Nunca superar un pH superior a 4, porque se destrúe a saxitoxina (P.S.P.); se fose necesario diminuí-lo pH, engadir con continua axitación CIH 5N.

Quenta-la mestura con axitación ata que empece a ferver usando unha placa calefactora e deixar que ferva durante cinco minutos evitando a formación de escumas. Arrefriar ata a temperatura ambiente; transferi-la mestura a unha probeta de 250 ml, e completa-lo volume ata 200 ml para compensa-la perda de líquido durante a ebulición, verificar que o pH final sexa 3 (pH entre 2-4); axitar e homoxeneizar. Deixar en repouso ata pousaren as partes sólidas e quedar translúcido o sobrenadante.

Se fose necesario, centrifugar a 3.000 rpm durante cinco minutos o líquido sobrenadante. Se o centrifugado non estivese totalmente límpido, filtrar a través dun papel de filtro recollendo o filtrado para efectua-la proba do bioensaio do rato.

3.3. Proba do bioensaio do rato:

Os pesos dos ratos deben ser de 17 a 23 g, usándose preferentemente ratos de peso 20 g ±1 g.

Débense empregar, como mínimo, tres ratos por mostra para determina-la mediana do tempo de morte. (Poderase utilizar un só rato para a determinación inicial do tempo de morte).

Inocular a cada rato por vía intraperitoneal 1 ml do líquido sobrenadante do extracto da mostra cen

trifugada. Anota-lo tempo de inoculación (para isto usar un cronómetro que poida medir segundos). Considérase o rato morto no momento en que se produce o derradeiro movemento respiratorio.

Se o tempo de morte do rato inoculado para calcula-la determinación inicial do tempo de morte é menor de cinco minutos, dilúese a mostra (usar dilucións 1:5; 1:10; etc.), para conseguir que o tempo de morte estea comprendido entre 5 e 7 minutos. Cando sexa necesario facer estas dilucións é preciso axusta-lo pH a 3 (rango entre 2-4).

Se o tempo de morte do rato inoculado para calcula-la determinación inicial do tempo de morte é maior de 7 minutos (ou hai supervivencia) deberanse inocular un mínimo de tres ratos para establece-la toxicidade da mostra.

Se os ratos sobreviven despois de que transcorresen 60 minutos, darase a proba por negativa, e indicarase tempo de non morte (T.N.M.)>60 minutos.

4. Cálculos:

Calcula-la mediana do tempo de morte do rato das tres probas realizadas (desbotar aqueles que T.N.M.>60 minutos).

Facendo uso da táboa de Sommer calcula-lo número de unidades rato (U.R.). Se o peso dos ratos fose superior a 21 g ou inferior a 19 g facer uso da táboa de corrección de pesos, e calcula-lo factor de corrección de peso.

Multiplícanse as unidades rato (U.R.) correspondentes ó tempo de morte calculado mediante a táboa de Sommer polo factor de corrección de peso para obte-las unidades de rato corrixidas (U.R.C.). Unha vez obtidas as U.R.C. para tódolos ratos na proba de grupo, determínase a mediana das U.R.C. para o grupo. Convértense as U.R.C., en lg equivalentes de saxitoxina por 100 g de vianda, mediante a fórmula seguinte:

lg equivalentes de saxitoxina/100 g de vianda de molusco= U.R.C. en lg/mlxFCxfactor de diluciónx200, sendo:

FC= Factor de conversión a microgramos de toxina equivalente a unha unidade rato.

U.R.C.= U.R. (táboa de Sommer).

O valor final exprésase en microgramos equivalentes de saxitoxina por 100 g de vianda e considéranse como potencialmente perigosas aquelas mostras que conteñan máis de 80 lg equivalentes de saxitoxina/100 g de vianda.

Considérase tempo de non morte (T.N.M. de supervivencia do rato) cando este é superior a 60 minutos ou, o que é equivalente, inferior a 0,875 U.R.

Defínese unha unidade rato como a cantidade de toxina contida en 1 ml de extracto ácido que mata un rato de 20 g de peso en 15 minutos, e é aproximadamente igual a 0,2 lg de saxitoxina (P.S.P.).

Táboa de Sommer

Tempo (minutos e segundos)	Unidades rató (U.R.)	Tempo (minutos e segundos)	Unidades rató (U.R.)

1:00	100	55	1,96
10	66,2	5:00	1,92
15	38,3	05	1,89
20	26,4	10	1,86
25	20,7	15	1,83
30	16,5	20	1,80
35	13,9	30	1,74
40	11,9	40	1,71
45	10,4	45	1,67
50	9,33	50	1,64
55	8,42	6:00	1,60
2:00	7,67	15	1,54
05	7,04	30	1,48
10	6,52	45	1,43
15	6,06	7:00	1,39
20	5,66	15	1,35
25	5,32	30	1,31
30	5,00	45	1,28
35	4,73	8:00	1,25
40	4,48	15	1,22
45	4,26	30	1,20
50	4,06	45	1,18
55	3,88	9:00	1,16
3:00	3,70	30	1,13
05	3,57	10:00	1,11
10	3,43	30	1,09
15	3,31	11:00	1,075
20	3,19	30	1,06
25	3,08	12:00	1,05
30	2,98	13	1,03
35	2,88	14	1,015
40	2,79	15	1,000
45	2,71	16	0,99
50	2,63	17	0,98
55	2,56	18	0,972
4:00	2,50	19	0,965
05	2,44	20	0,96
10	2,38	21	0,954
15	2,32	22	0,948
20	2,26	23	0,942
25	2,21	24	0,937
30	2,16	25	0,934
35	2,12	30	0,917
40	2,08	40	0,898
45	2,04	60	0,875
50	2,00

Táboa de corrección de peso dos ratos

Peso	Factor de corrección	Peso	Factor de corrección

10	0,50	17,5	0,905
10,5	0,53	18	0,93
11	0,56	18,5	0,95
11,5	0,59	19	0,975
12	0,62	19,5	0,985
12,5	0,65	20	1,000
13	0,675	20,5	1,015
13,5	0,70	21	1,03
14	0,73	21,5	1,04
14,5	0,76	22	1,05
15	0,785	22,5	1,06
15,5	0,81	23	1,07
16	0,84
16,5	0,86
17	0,88

5. Cálculo do factor de conversión (FC).

Procédese da seguinte maneira:

Cóllense alícuotas de 10 ml da solución patrón internacional de 1 lg/ml e vanse diluíndo con 10, 15, 20, 25 e 30 ml de auga destilada sucesivamente, ata chegar a aquela dilución que, en ensaios cun mínimo de tres ratos, trala inxección intraperitoneal de 1 ml, provocan unha mediana do tempo de morte do rato entre 5-7 minutos. O pH das dilucións debe estar entre 2 e 4. Fanse ensaios con dilucións adicionais, con incrementos de 1 ml; por exemplo: se a dilución que provoca unha mediana do tempo de morte entre 5 e 7 minutos é a de 25 ml de auga engadida, fanse ensaios con alícuotas de 10 ml da solución patrón internacional diluída con 24 ml e con 26 ml de auga destilada.

Nestes ensaios preliminares identifícanse dúas ou preferiblemente as tres dilucións que provocan unha mediana do tempo de morte entre 5 e 7 minutos; fanse ensaios con estas dilucións, en cada caso cun grupo de dez ratos. De novo cada rato debe recibir 1 ml da dilución, por inxección intraperitoneal.

Repítense estes ensaios 1 ou 2 días despois usando as dilucións xa preparadas que provocaron un tempo de morte entre 5 e 7 minutos.

Repítese todo o protocolo usando dilucións preparadas a partir dunha nova solución patrón internacional de 1 lg/ml.

Calcúlase para cada grupo de dez ratos a mediana do tempo de morte. Se tódolos grupos de dez ratos inxectados cunha dilución dada mostran unha mediana de tempo de morte menor de 5 minutos ou maior de 7 minutos, exclúese esta dilución da análise posterior. Pero se a mediana do tempo de morte de alomenos un dos grupos está dentro do rango 5-7 minutos, débense incluír tódolos grupos

de ratos inxectados con esta dilución na análise (aínda que a mediana do tempo da morte para algún grupo se encontre fóra deste rango).

Para cada grupo non excluído da análise, consúltase a táboa de Sommer para obter un valor de unidades rato por ml a partir da mediana do tempo de morte. Desta forma para cada grupo calcúlase o factor de conversión (FC). Para calcula-lo factor de conversión (FC), divídese a cantidade de lg STX/ml da dilución elixida polo número de unidades de rato (U.R.) achadas na táboa de Sommer. O valor de FC, polo tanto, corresponde ós lg de toxina equivalentes a unha unidade rato. Calcu-la media dos valores de FC de cada grupo, utilizando esta media como FC para a monitorización dos ensaios rutineiros.

Débese comprobar cunha periodicidade mínima semestral o valor do FC ou no caso no que un cambio nas características dos ratos utilizados faga sospeitar unha variación no valor do FC. A comprobación do FC realízase inxectando 5 ratos cunha das dilucións apropiadas da solución de patrón internacional de 1 lg/ml.

O valor do FC debe estar dentro dun rango definido polo valor do FC ±20%; se non está dentro deste rango, debe repetirse o ensaio cun grupo de 5 ratos e outro de 10; xuntando este grupo de 5 ratos cos 5 xa ensaiados, obtéñense dous grupos de 10 ratos. Calcúlase o FC para cada grupo e obtense a media de ámbolos dous, que se converterá nun novo valor do FC que se vai utilizar.

Se o novo valor do FC difire do orixinal en máis dun 20%, indica que houbo un cambio importante na resposta dos ratos á toxina ou na execución do ensaio. Variacións desta magnitude requiren un novo cálculo do valor do FC.

As comprobacións repetidas do valor do FC debe diferir entre si menos dun 20%. Se en sucesivas comprobacións a diferencia encontrada é máis alta, hai que investiga-la posible existencia de variables metodolóxicas non controladas ou non recoñecidas antes de continua-los ensaios.

6. Referencias.

6.1. A.O.A.C., Official Methods of Analysis (1995) Official Method 959.08 Paralytic Shellfish Poison. Biological Method. Chapter 35, pp. 21-22.

6.2. Sommer H., Meyer K. F. (1937) Arch. Pathol., 24, 560.

ANEXO II

Método de bioensaio para a determinación de enterotoxina (D.S.P.) en moluscos bivalvos e outros organismos procedentes da pesca, o marisqueo e a acuicultura.

1. Principio: As biotoxinas liposolubles (D.S.P.) extráense en medio orgánico (mediante acetona) dun homoxeneizado da vianda ou do hepatopáncreas ou glándula dixestiva, e posterior investigación usando o bioensaio do rato.

2. Reactivos:

2.1. Acetona PA.

2.2. Tween 60.

2.3. Auga destilada.

2.4. Éter Dietílico PA.

2.5. Diclorometano PA.

3. Procedemento:

3.1. Preparación da mostra:

No caso dos moluscos bivalvos, limpalos externamente con auga limpa. Con axuda dun coitelo abrilos seccionando os músculos abductores e lava-lo contido das cunchas (vianda ou carne), con suficiente cantidade de auga para eliminar tódalas materias estrañas que poida conter. Separa-la carne das cunchas apartando os músculos e tecidos que estean en contacto con ela. Non usa-la calor nin anestésicos para abrilos.

Separa-lo hepatopáncreas ou glándula dixestiva do resto da vianda, refugando esta. Os hepatopáncreas ou glándula dixestiva deposítanse nun funil de filtración ó que previamente se coloca papel de filtro ou nun coador, con obxecto de separa-la maior cantidade de auga. Posteriormente colócanse os hepatopáncreas ou glándulas dixestivas nun papel de filtro e déixanse secar durante uns minutos.

Coa axuda dun homoxeneizador ou muíño triturar uns 30 gramos de hepatopáncreas ou glándula dixestiva ata conseguir unha pasta o máis fina e homoxénea posible.

3.2. Extracción da enterotoxina (D.S.P.).

Pesar 20 g de hepatopáncreas ou glándula dixestiva triturada e homoxeneizada, tal como se describiu no punto 3.1.

Os 20 g de hepatopáncreas ou glándula dixestiva extráense con tres porcións sucesivas de 50 ml de acetona cada unha, durante cinco minutos a temperatura ambiente.

En cada unha das extraccións, déixase sedimenta-la fase sólida (hepatopáncreas ou glándula dixestiva), e recóllese toda a fracción acetónica que queda na parte superior (pódese facer usando unha pipeta). A fracción acetónica debe estar límpida; se fose necesario, filtraríase ou decantaríase novamente.

As tres fraccións acetónicas combinadas evapóranse usando un rotavapor ou unha bomba de baleiro. Co obxecto de axudar á evaporación, a fracción acetónica mergúllase nun baño de auga que debe estar a unha temperatura que non supere os 60º C.

O extracto acetónico evaporado redisólvese engadindo 4 ml dunha disolución ó 1% en auga de Tween 60 (2.2). A relación peso/volume que se vai obter será de 1 ml de solución acuosa ó 1% de Tween 60 por cada 5 g de hepatopáncreas ou glándula dixestiva iniciais.

3.3. Proba do bioensaio do rato.

Inxéctanse alícuotas de 1 ml da disolución anterior por vía intraperitoneal a tres ratos machos que teñan un peso aproximado de 20 g. Os ratos obsérvanse durante un tempo mínimo de 12 horas.

No caso de observar nos ratos unha sintomatoloxía que puidera indicar inequivocamente a presencia de biotoxinas P.S.P., A.S.P durante aproximadamente a primeira media hora posterior á inxección, ou no caso de realizarse a extracción a partir de molusco eviscerado e co fin de evita-la interferencia de sales ou metais, seguirase o procedemento 4.

3.4. Extracción de enterotoxina D.S.P. en moluscos bivalvos e outros organismos procedentes da pesca, o marisqueo e a acuicultura nos que non se dispoña do hepatopáncreas ou glándula dixestiva.

Cando na mostra que se vai analizar non se dispoña de hepatopáncreas ou glándula dixestiva, pódese face-la extracción da enterotoxina D.S.P. a partir de toda a vianda. Neste caso, será necesario partir de 200 g de vianda. Como práctica xeral, utilizarase un volume de acetona igual a tres veces o peso da mostra que se vai analizar, para a extracción inicial, e un volume de dúas veces o peso da mostra para unha segunda extracción, aínda que, dependendo da especie de molusco, podería ser necesario variar estes volumes.

Unha vez evaporado o extracto acetónico, e co obxecto de eliminar interferencias por sales ou metais que poidan estar na mostra seguirase o procedemento 4.

4. Procedemento de eliminación de interferencias.

4.1. Principio. Esta modificación do bioensaio do rato baséase no efecto tóxico agudo causado por un extracto orgánico da mostra analítica evaporada e redisolta nunha solución acuosa de Tween 60. Para a obtención deste extracto, a mostra extráese primeiramente con acetona. Unha vez evaporada a acetona, realízase unha partición do extracto en auga e éter dietílico co fin de refugar na fase acuosa as substancias polares tales como toxinas PSP, toxinas ASP, sales ou metais que puideran interferir co ensaio.

4.2. Procedemento.

O extracto acetónico evaporado procedente do punto 3.2 ou 3.4 resuspéndese nuns 15 ml de auga. Esta suspensión acuosa extráese con 3 porcións sucesivas duns 50 ml de éter dietílico. Dado que a solubilidade das Yessotoxinas é maior en diclorometano que en éter dietílico, no caso de sospeitarse a presencia de Yessotoxinas na mostra, é aconsellable substituí-lo éter dietílico por diclorometano. As fases orgánicas combinadas lávanse con dúas porcións sucesivas duns 15 ml de auga para finalmente evapora-la fase orgánica ata a sequidade.

O extracto evaporado redisólvese engadindo 4 ml dunha disolución ó 1% en auga de Tween 60 (2.2). A relación peso/volume para obter será de 1 ml de

solución acuosa ó 1% de Tween 60 por cada 5 g de hepatopáncreas ou glándula dixestiva iniciais ou de 1 ml de solución acuosa ó 1% de Tween 60 por cada 50 g de vianda.

4.3. Proba do bioensaio do rato.

Inxéctanse alícuotas de 1 ml da disolución anterior por vía intraperitoneal a tres ratos machos que teñan un peso aproximado de 20 g. Os ratos obsérvanse durante un tempo mínimo de 12 horas.

5. Criterio de positividade.

De producirse a morte de polo menos dous dos tres ratos inxectados antes de 12 horas, indicará a presencia de enterotoxina (D.S.P.) en niveis considerados como perigosos e que poden provocar un risco para a saúde pública.

6. Referencias.

6.1. Yasumoto T., Oshima Y. e Yamaguchi M. (1978) Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 44, 1249-1255.

6.2. Yasumoto T., Murata M., Oshima Y., Matsumoto K. e Clardy J. (1984) In «Seafood Toxins». Ragelis E. P., Ed. ACS. 207-214.

6.3. Cacho E. (1993) En «Tercera Aula Ibérica sobre Fitoplancton Tóxico y Biotoxinas Marinas» Mariño J. et al., Eds. 79-82.

6.4. McCulloch A., Boyd R., Freitas S., Foxall R., Jamieson W., Laycock M., Quilliam M. e Wright J. (1989) J. Assoc. Offic. Anal. Chem. 72, 384-386.

Disposición derrogatoria

Quedan derrogados os anexos I e II do Decreto 116/1995, polo que se regula o control das biotoxinas en moluscos bivalvos e outros organismos procedentes da pesca, o marisqueo e a acuicultura e tódalas disposicións de igual ou inferior rango que se opoñan ó disposto neste decreto.

Disposicións derradeiras

Primeira.-Calquera modificación deste decreto se realizará por iniciativa conxunta da Consellería de Sanidade e Servicios Sociais e da Consellería de Pesca, Marisqueo e Acuicultura.

Segunda.-Facúltanse as consellerías de Sanidade e Servicios Sociais e Pesca, Marisqueo e Acuicultura para dictaren, no ámbito das súas respectivas competencias, as disposicións necesarias para o desenvolvemento e execución deste decreto.

Terceira.-O presente decreto entrará en vigor o día seguinte ó da súa publicación no Diario Oficial de Galicia.

Santiago de Compostela, vintetrés de abril de mil novecentos noventa e nove.

Manuel Fraga Iribarne

Presidente

Jaime Pita Varela

Conselleiro da Presidencia e Administración Pública